SARS-CoV-2属于冠状病毒家族中的Beta冠状病毒属。SARS-CoV-2是一种包膜病毒，它包含一个单链正链RNA基因组，长度为29,个核苷酸，具有11个开放阅读框(ORF)，可编码27种病毒蛋白。ORF1a/b的长度为21,个核苷酸，编码16种非结构蛋白(nsp1–nsp16)。基因组的最后一部分是个核苷酸，编码四种结构蛋白和六种辅助蛋白。结构蛋白是刺突（S、病毒附着和主要抗原蛋白）、包膜（E）、基质（M）和核衣壳（N）蛋白，而辅助蛋白包括ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10，如下图所示。

图上所示：SARS-CoV-2的基因组组织。SARS-CoV-2RNA基因组的长度约为30kb，被组织成至少11个开放阅读框(ORF)。病毒基因组在50个末端加帽，在30个末端聚腺苷酸化。ORF1a和ORF1b占病毒基因组的三分之二，编码非结构蛋白（nsp1到nsp16），而四种结构蛋白，包括刺突(S)、包膜(E)、膜(M)和核衣壳(N)，由结构基因编码。此外，辅助蛋白也由结构基因编码。在50个末端（SL1到SL8）、ORF1a/b移码区(FSE)和30个非翻译区也显示了已识别的顺式作用调节元件。SL：茎环；TRS：转录调控序列；FSE：移码元件；PK：假结；HVR：高变区。

使用反向遗传系统工程化SARS-CoV-2

反向遗传系统是研究病毒和确定对策的关键工具。为了应对持续的COVID-19大流行，我们最近开发了一种针对严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）的传染性互补DNA（cDNA）克隆。反向遗传系统可用于快速工程改造具有所需突变的病毒，以在体内和体外研究病毒。还可以将病毒设计用于减毒活疫苗的开发，并使用报道基因进行工程设计，以促进血清诊断，疫苗评估和抗病毒筛选。因此，SARS-CoV-2的反向遗传系统将被广泛用于基础研究和转化研究。但是，由于冠状病毒基因组的大小很大（约30,个核苷酸长）和一些有毒的基因组元件，SARS-COV-2反向遗传系统的操纵不是一件容易的事，需要复杂的方法。在这里，我们描述了如何设计重组SARS-CoV-2的技术细节。总体而言，该过程包括六个步骤：（i）制备七个含有SARS-CoV-2cDNA片段的质粒，（ii）通过限制性酶切消化这七个质粒来制备高质量的DNA片段，（iii）组装这七个质粒cDNA片段变成基因组长度的cDNA，（iv）从基因组长度的cDNA体外转录RNA，（iv）将基因组长度的RNA电穿孔到细胞中以回收重组病毒，以及（vi）表征被拯救的病毒。该协议将使来自不同研究背景的研究人员能够掌握反向遗传系统的使用，从而加速COVID-19研究。

当前的III期候选疫苗

1.减毒活疫苗

目前，截至年4月13日，只有两个活体减毒SARS-CoV-2候选疫苗处于临床I期。第一个候选疫苗名为COVI-VAC（试验编号NCT），由Codagenix与印度血清研究所合作开发。该候选疫苗的试验已于年12月11日开始。第二个候选疫苗名为MV--（试验编号NCT），由Meissa疫苗公司开发，预计试验开始日期为年3月31日。一般来说，减毒活疫苗（图2A）通常是通过使用病毒的无毒株和/或构建病毒的基因弱化形式来生产的，其有限的几轮复制不足以导致疾病，但可以引起类似于自然感染所诱发的免疫反应。通过让病毒暴露在不利的条件下，如在不敏感的宿主或细胞中低温生长，可以实现病毒的减弱。遗传修饰也可以通过RG系统来实现密码子的去优化或删除那些对人体有害的基因。

使用活体减毒SARS-CoV-2候选疫苗的优点包括瞄准和刺激强大的粘膜和细胞免疫力，这是保护的关键，而不需要佐剂。然而，这种类型的疫苗有一些缺点，例如：(1)SARS-CoV-2已被证明可在受感染病人的粪便中排出，这就产生了一个重大的安全问题，即SARS-CoV-2减毒活疫苗可能在被接种者的粪便中排出，从而导致潜在的病毒传播给未接种者。(2)使用SARS-CoV-2减毒活疫苗可能会增加疫苗株与流行的野生型病毒之间的重组风险，从而产生新的病毒变体。(3)生产和配制过程是劳动密集型的，需要严格的质量控制，这使得大规模的疫苗生产对大流行病的反应很慢。

2、灭活病毒疫苗

如图2B所示，灭活病毒疫苗通常是通过在易感细胞系（如VeroE6）中培养SARS-CoV-2的工作病毒种子，然后进行化学灭活而产生的。此外，灭活疫苗通常用明矾或特殊油类佐剂，然后进行肌肉注射；这往往会产生广泛的免疫反应，因为疫苗会诱导靶向一系列不同的病毒原蛋白，如S、M和N。这种疫苗的靶向免疫反应通常是体液和细胞反应，几乎没有反应性，从而使疫苗的安全性很高。对这类疫苗的开发已经有70多年的研究。然而，这类疫苗的生产和配方目前面临三个挑战。(1)在生物安全级别（BSL）3的设施中，将传染性SARS-CoV-2活体培养到高滴度（放大），这对安全有很大影响。(2)对培养的病毒进行不充分的化学灭活将对生产设施的工人构成潜在的风险，导致疾病的爆发和/或有害的免疫反应。(3)在短时间内制造数十亿剂量的病毒是一个挑战，使对大流行病的反应特别缓慢。

3、蛋白质亚单位疫苗

蛋白质亚单位候选疫苗（图2C）依赖于在不同的表达系统（包括昆虫、哺乳动物和/或酵母细胞）中表达S蛋白或其简单的一个区域，如受体结合域（RBD），或其他病毒基因。因此，这种类型的疫苗缺乏许多缺点，如预先存在的抗载体免疫力、恢复毒力和病毒不完全灭活的安全问题；因此，它们被认为在给被接种者注射后非常安全。目标免疫反应主要是体液免疫，通常通过与佐剂的结合来提高免疫力。

4、腺病毒载体疫苗

如图2D所示，该疫苗依赖于使用由RG系统生成的弱化病毒载体。这些疫苗的优势在于其生产过程的可行性和广泛的靶向免疫反应，包括体液和细胞反应，而无需使用佐剂。此外，这些优势和多年的经验使得这一平台最近产生了一些许可的疫苗，如Ad-26引物-调制疫苗安卡拉（MVA）助推型埃博拉病毒疫苗。然而，目前在使用这些疫苗时也有一些缺点。(1)对所使用的病毒载体已有的免疫力会使开发的候选疫苗无效；然而，这可以通过使用另一种类型的疫苗，如DNA疫苗，或通过改变主要剂量和加强剂量之间的给药途径来最小化。(2)病毒载体本身会诱发免疫反应，随后干扰未来使用相同载体的疫苗。(3)疫苗接种者的强烈反应表明使用某些病毒载体会诱发遗传毒性；然而，通过使用混合载体可以将这种情况降到最低。(4)在生产过程中出现病毒重组的机会。

5、DNA和RNA疫苗

DNA疫苗（图2E）取决于将SARS-CoV-2的S基因克隆到含有强大的哺乳动物原动力（如CMV和/或SV40）的细菌质粒中，然后在有能力的细菌中进行大量的质粒培育。年，通过将表达氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和β-半乳糖苷酶的DNA载体注入小鼠骨骼肌，测试了第一个概念验证的DNA疫苗。DNA疫苗可能存在不同的抗原表达机制。(1)抗原呈递细胞（APC）如树突状细胞对质粒转染的体细胞（如肌细胞）的吞噬，导致抗原呈递给CD4和CD8T细胞。(2)吸引APC到注射部位，随后用注射的质粒DNA转染；表达的抗原通过主要组织相容性（MHC）I类和II类复合物呈现给T细胞。

相比之下，RNA疫苗在许多临床前研究中显示出非常有前途的结果，最近针对COVID-19的研究取得了重大成功，P?zer和Moderna的美国FDAEUA批准的候选疫苗的保护率分别达到95%和94.5%。一般来说，mRNA疫苗的开发是一个简单的过程。一旦确定了新出现的病原体的目标抗原，就对该基因进行测序，用化学方法合成，如添加特定的信号肽和跨膜结构（图2）以锁定某些细胞位置，最后克隆到质粒DNA中。然后将质粒DNA进行体外转录，之后候选疫苗就可以在临床前试验中进行测试。在体内，mRNA候选疫苗利用宿主细胞机制将mRNA翻译成相应的抗原，从而刺激体液和细胞免疫反应。

目前，有两种类型的mRNA疫苗。(1)传统的或常规的mRNA编码感兴趣的基因（GOI），由50和30非翻译区（UTR）组成。(2)主要来自正股RNA病毒基因组的自我扩增mRNA，如阿尔法病毒和?aviviruses。它们与传统的mRNA相似，但编码了细胞内RNA扩增所需的病毒复制机器，刺激了GOI的高水平表达。传统的和自我扩增的mRNA疫苗都有类似于真核生物mRNA的成分，如帽结构、50UTR，然后是GOI的ORF、30UTR，最后是聚A尾。针对不同病毒目标的mRNA疫苗的制造只需要替换编码GOI的序列，而不影响RNA分子的物理化学特性。

这种疫苗有几个优点，因为它同时针对体液和细胞免疫反应，有很高的安全性，不会导致人类基因组的整合，没有抗载体免疫力，也没有感染病毒的机会。然而，这个平台也有一些缺点。(1)在非常低的温度下储存（表1）是保持疫苗稳定性的必要条件。(2)生产过程的高成本使这种疫苗对低收入国家来说并不理想。(3)缺乏系统的方法来确定最终配方的mRNA疫苗的主要物理化学降解机制。(4)该平台是一个全新的平台，目前还缺乏关于其规模化的知识。

图2.SARS-CoV-2疫苗平台的概要

COVID-19疫苗对SARS-CoV-2突发变种的有效性

一项体外研究表明，ChAdOx1nCoV-19（AZD）疫苗对新的B.1.1.7变体提供了足够的保护，在B.1.1.7变体的有症状病例中，有70.4%（95%CI43.6-84.5）的保护，而在非B.1.17变体的有症状病例中，有81.5%的保护。另一项研究表明，P?zer/BioNTech公司的BNTb2疫苗的两剂方案可激发针对英国和南非变种的中和抗体。然而，两剂ChA-dOx1nCoV-19（AZD）疫苗对南非B.1.变体引起的轻度至中度COVID-19症状没有效力。mRNA疫苗，包括P?zer/BioNTech（BNTb2）和Moderna（mRNA-）疫苗对英国和南非变体的效力显著降低。因此，应继续评估目前批准的疫苗，并监测不可避免地不断出现的新SARS-CoV-2变体。

展望

应对新出现和重新出现的病毒性疾病的主要挑战始终是在低收入和中等收入国家，那里至少有一半的全球人口。因此，为了防治任何新出现的病毒性疾病，所开发的疫苗的规模化生产和全球分发应该尽可能简单明了，这也是麻疹疫苗等活疫苗的优势。然而，对于已经获得欧盟许可或正在进行第三阶段试验的SARS-CoV-2候选疫苗来说，情况就不同了，因为这些候选疫苗中有许多是低收入国家不可能负担得起的，也不会有成本效益。这一点非常重要，因为有必要在任何病毒变异体出现之前，在短时间内为这一庞大的人群接种疫苗以建立群体免疫力。SARS-CoV-2灭活疫苗可能比活疫苗更有价值，因为它的安全性更强，特别是对脆弱人群。然而，扩大这种疫苗的规模需要在BSL3条件下使用大量繁殖的病毒，而这些实验室和设施很少位于中低收入国家。基因疫苗（基于DNA和RNA的疫苗）具有相当大的前景；然而，它们最近才被开发出来，其在人类中的长期安全性和有效性表现需要进一步调查。

此外，最近EAU批准的mRNASARS-CoV-2疫苗价格昂贵，需要特殊的物流运输到中低收入国家，这可能不是这些国家的最佳选择。有许多病毒载体在临床试验中显示出非常有希望的结果，但预先存在的免疫力是其中大多数的主要挑战。因此，拥有能够规避已有免疫力挑战并能以低成本扩大规模的病毒载体，如麻疹、AAV、某些血清型的腺病毒（Chim-panzee或Ad-26）和NDV载体，将是快速生产和分配有效疫苗的理想平台。

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